文献解析|Nature—单细胞RNA测序首次揭秘人类胎肝造血作用(下)
本期，将继续解读发表于《Nature》的这篇文献。
影响因子：43.070
通讯作者：Cambridge大学Wellcome Sanger研究院的Sam Behjati博士和Sarah A. Teichmann教授，血液内科系和Wellcome-MRC剑桥干细胞研究院的Elisa Laurenti博士，以及Newcastle大学Muzlifah Haniffa教授。
通讯作者实验室：Teichmann实验室
开放获取数据：原始测序数据和表达矩阵存储在ArrayExpress，编号E-MTAB-7407；代码脚本；在线交互式数据。
上期推文介绍了研究者对4-17周人类胎肝及NLT(非淋巴组织，包括皮肤、肾脏和卵黄囊)单细胞RNA测序数据进行降维聚类分析，并根据差异基因集(DEGs)注释细胞类型，发现存在27种细胞类型。
随后，研究者根据DEGs中编码细胞表面蛋白的基因设计了FACS(荧光激活细胞分选) panel，对使用该panel分离到的细胞进行bulk转录组测序和单细胞RNA测序后，对数据进行降维聚类分析并根据标志基因注释细胞类型，确认了单细胞RNA测序得到结果的有效性。
成年人的血液和免疫系统是由骨髓维持着。但是在人类发育早期，卵黄囊和肝脏的造血作用维持了胎儿发育期间对大量氧气的需求【1】。因此，研究者对人类发育早期的造血作用进行了研究。结果显示，在发育早期皮肤能促进红细胞生成，是胎肝以外能产生红细胞的器官。
前人研究报道了人类胎肝中存在T和B淋巴细胞，NK(自然杀伤细胞)以及ILCs(先天淋巴细胞)【14-16】。研究者的分析结果显示：
❖ 胎肝中存在两个淋巴分支，一个是NK-T-ILC谱系，一个是B细胞谱系(图11左)；
❖ 不同孕期的早期淋巴样/T淋巴细胞聚群表达的基因不同(图11左)；
❖ 淋巴样分支中，NK细胞和ILC前体细胞有着共同起源，这与前人在人和老鼠中发现NK和ILCs有相同祖细胞的结果相一致【17-18】(图4a, 图11左)；
❖ B细胞谱系的细胞展现出连续分化状态，从初始“B祖细胞前体”到B祖细胞，再到B细胞前体(图4a, 图11左)；
❖ 7-8周已经观察到B细胞前体，但直到9周后才观察到成熟B细胞(图1, 图11左)；
❖ 孕期观察到HSC/MPPs中NFKBIA，一种NF-κB抑制剂的表达降低，而Kupffer细胞中的TNFSF13B(BAFF)表达增加。NF-κB和BAFF是B细胞存活和分化因子【19】。这意味着需要进一步研究控制胎肝B细胞分化的细胞内在与组织微环境因子；
图11 胎肝HSC/MPP和淋巴细胞的轨迹分析结果（左）和胎肝、皮肤、肾脏及YS中淋巴样细胞的轨迹分析结果（右）【5】。
❖ 与肝脏和YS相比，NLT中不存在HSC/MPP和B祖细胞前体，但存在B祖细胞、B细胞前体和B细胞；
❖ NLT和胎肝中的早期淋巴样/T淋巴细胞、NK细胞和ILCs有相同转录信号，但组织特异性表达的趋化因子和细胞毒性颗粒表明NK细胞在皮肤和肾脏中成熟并适应组织；
❖ NLT中ILC前体细胞的特征标记不全，缺乏成熟ILC1-3的转录因子；
❖ YS中存在NK细胞和ILC前体细胞(图11右)；
这些结果表明胎肝和YS中的NK和ILC前体细胞进入NLTs后分化并表达组织相关的基因。
小鼠组织中的巨噬细胞来源于YS和胎肝中的前体细胞【20-21】，而DCs来源于独立的骨髓HSC/MPP单核细胞谱系【22】。
在该研究中，研究者发现：
❖ 早在7周就发现胎肝和NLT中存在髓样祖细胞、单核细胞、巨噬细胞以及DC1-2聚群(图1, 图12a)；
❖ HSC/MPP通过3种中间体产生髓样细胞系，分别是表达CD34、SPINK2等的中性粒细胞-髓样祖细胞、单核细胞前体和DC前体细胞(图4a, 图7a)；
图12 胎肝、子宫蜕膜/胎盘和YS中HSC/MPP、髓样祖细胞、单核细胞和巨噬细胞的轨迹分析结果(a)，以及这些细胞群的PAGA关联度值【5】。
❖ 巨噬细胞转录组图谱具有高度的组织特异性，驻留组织内的巨噬细胞亚型具有关联性，难以认识潜在的发生关系(图12)；
❖ 不同于巨噬细胞，NLT和肝脏中的单核细胞与DCs联系紧密，虽然在DCs中观察到组织特异性基因表达模式；
❖ 即使在无菌的胎儿环境中也存在激活的DC，表明胎儿DCs在介导耐受中起到了积极的作用【23】。
研究者使用轨迹分析方法分析HSC/MPP细胞的分化潜能，发现(图13)：
❖ 观察到的HSC/MPP细胞放射状分化轨迹，与近期出生后小鼠和人类scRNA-seq分析结果中观察到的相一致【24-26】；
❖ 分化轨迹的基部是表达CLEC9A、HLA-DRA以及高水平初始基因(包括MLLT3)的聚群，这与多能LT(长期重建)-HSC细胞群相一致【27】；
❖ HSC/MPP聚群基因表达介于LT-HSCs和早期祖细胞之间，后者与人类初始淋巴样ST(短期)-HSCs【27】相似，还可在该聚群中分辨出偏小鼠红系细胞的MMP2和偏小鼠髓样细胞的MMP3【28-29】，这意味着早期转录组起始状态包含了MMP池内所有的分化分支；
a
b
图13 肝脏HSC/MPP和早期造血祖细胞聚群的轨迹分析结果(a)，以及在HSC/MPP转化为胎肝中性粒细胞-髓样祖细胞，MEMP和B祖细胞前体时，上调/下调的差异基因表达水平变化【5】。
根据以上发现，研究者做出了一个假设：发育着的胎肝是由不同潜能的HSC/MPP组成的。对FACS分离出的CD34+CD38+，CD34+CD38−CD45RA−以及CD34+CD38−CD45RA+细胞进行scRNA-seq以及单细胞克隆分化分析，得到的结果支持了这一假设。这也与研究者观察到的孕早期胎肝中主要存在红系细胞，晚一点的时期主要存在淋巴系细胞相一致(图1, 图11a)。
进一步研究发育期间造血组织的HSC/MPP和祖细胞，结果表明：
❖ YS及胎肝中的祖细胞和HSC/MPP的增殖潜能加强(图14a)；
❖ 随着孕期增加，G0期的胎肝HSC/MPP增多，表明随着胎儿发育这些细胞逐渐进入静息状态(图14b, c)；
❖ 胎肝HSC/MPP的热激蛋白编码基因高表达(HSPA1A)，这种蛋白可以维持基因组和蛋白质组完整性，降低MHC-I(HLA-B)的水平。该基因的高表达意味着与脐带血和成人骨髓HSC/MPPs相比，胎肝HSC/MPP抗原呈递能力降低(图14d)。
a
b
c
d
图14 胎肝、YS、脐带血和成人骨髓中，表达MKI67的HSC/MPPs和早期祖细胞比例(a)；CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞中，细胞周期不同的细胞的比例(b)；G0期细胞的比例(c)；YS祖细胞、脐带血HSCs和成人骨髓HSCs选定基因的表达水平，这些基因在胎肝HSC/MPP中的表达水平显著不同(d)。
研究者的这些发现阐述了孕期第一、二阶段HSC/MPP数量、增殖和分化潜能出现的变化。这意味着可能存在额外的功能机制，在孕期第一、二阶段调控胎肝造血作用。
孕期第一、二阶段HSC/MPP发生的变化对胎儿发育十分重要：通过造血作用过程，胎肝首先建立了有效的氧气运输系统。随后，胎儿的血液和免疫系统逐渐发育完整。
“第一次有人这样详细地描绘了血液和免疫系统发展的完整情况。”Muzlifah Haniffa教授，也是该文章的通讯作者之一说道。
得益于单细胞RNA测序技术，科学家首次建立了人类胚胎发育期间的肝脏细胞图谱，为认识人类胎儿血液和免疫系统的发展提供了重要见解。
这不仅能帮助科学家们进一步认识正常的发育过程，还能帮助开发针对如白血病和免疫紊乱等疾病的诊疗新策略。
此外，Wellcome-MRC剑桥干细胞研究院以及剑桥大学血液内科Elisa Laurenti博士，同时也是该项研究的通讯作者之一，说到：“这个研究显示了在很短时间内，肝脏如何使血液和免疫细胞发生变化，甚至是在怀孕的7-17周。如果我们可以理解什么使得肝脏中的肝细胞能够如此擅长制造血细胞，这将对再生医学有着十分重要的影响。”
参考文献
1.Press Office. (2019). “Cell map of liver shows blood and immune system development.” Newcastle University. https://www.ncl.ac.uk/press/articles/latest/2019/10/humancellmap/.
2.Parekh, C. & Crooks, G. M. (2013). “Critical differences in hematopoiesis and lymphoid development between humans and mice.” J. Clin. Immunol. 33, 711–715.
3.Ivanovs, A. et al. (2017). “Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.” Development 144, 2323–2337.
4.Holt, P. G. & Jones, C. A. (2000). “The development of the immune system during pregnancy and early life.” Allergy 55, 688–697.
5.Popescu, D., et al. (2019). “Decoding human fetal liver haematopoiesis.” Nature 574, 365–371.
6.Ohls, R. K. et al. (1995). “Neutrophil pool sizes and granulocyte colony-stimulating factor production in human mid-trimester fetuses.” Pediatr. Res. 37, 806–811.
7.Kashem, S. W., Haniffa, M. & Kaplan, D. H. (2017). “Antigen-presenting cells in the skin.” Annu. Rev. Immunol. 35, 469–499.
8.An, X. et al. (2014). “Global transcriptome analyses of human and murine terminal erythroid differentiation.” Blood 123, 3466–3477.
9.Gautier, E.-F. et al. (2016). “Comprehensive proteomic analysis of human erythropoiesis.” Cell Rep. 16, 1470–1484.
10.Dedhia, P., Kambayashi, T. & Pear, W. S. (2008). “Notch2 paves the way to mast cells by Hes1 and Gata3.” Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 7629–7630.
11.Okada, Y. et al. (2003). “Homeodomain proteins MEIS1 and PBXs regulate the lineage-specific transcription of the platelet factor 4 gene.” Blood 101, 4748–4756.
12.Klei, T. R. L., et al. (2017). “From the cradle to the grave: the role of macrophages in erythropoiesis and erythrophagocytosis.” Front. Immunol. 8, 73.
13.Kessel, K. U. et al. (2017). “Emergence of CD43-expressing hematopoietic progenitors from human induced pluripotent stem cells.” Transfus. Med. Hemother. 44, 143–150.
14.Gale, R. P. in Fetal Liver Transplantation (eds Touraine, J.-L., Gale, R. P. & Kochupillai, V.) 45–56 (Springer, 1987).
15.Phillips, J. H. et al. (1992). “Ontogeny of human natural killer (NK) cells: fetal NK cells mediate cytolytic function and express cytoplasmic CD3ε,δ proteins.” J. Exp. Med. 175, 1055–1066.
16.Forkel, M. et al. (2017). “Composition and functionality of the intrahepatic innate lymphoid cell-compartment in human nonfibrotic and fibrotic livers.” Eur. J. Immunol. 47, 1280–1294.
17.Spits, H. et al. (2013). “Innate lymphoid cells—a proposal for uniform nomenclature.” Nat. Rev. Immunol. 13, 145–149.
18.Chen, L. et al. (2018). “CD56 expression marks human group 2 innate lymphoid cell divergence from a shared NK cell and group 3 innate lymphoid cell developmental pathway.” Immunity 49, 464–476.
19.Almaden, J. V. et al. (2016). “B-cell survival and development controlled by the coordination of NF-κB family members RelB and cRel.” Blood 127, 1276–1286.
20.Stremmel, C. et al. (2018). “Yolk sac macrophage progenitors traffic to the embryo during defined stages of development.” Nat. Commun. 9, 75.
21.Ginhoux, F. & Jung, S. (2014). “Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.” Nat. Rev. Immunol. 14, 392–404.
22.Murphy, T. L. et al. (2016). “Transcriptional control of dendritic cell development.” Annu. Rev. Immunol. 34, 93–119.
23.McGovern, N. et al. (2017). “Human fetal dendritic cells promote prenatal T-cell immune suppression through arginase-2.” Nature 546, 662–666.
24.Tusi, B. K. et al. (2018). “Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.” Nature 555, 54–60.
25.Grün, D. et al. (2016). “De novo prediction of stem cell identity using single-cell transcriptome data.” Cell Stem Cell 19, 266–277.
26.Velten, L. et al. (2017). “Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process.” Nat. Cell Biol. 19, 271–281.
27.Belluschi, S. et al. (2018). “Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors.” Nat. Commun. 9, 4100.
28.Cabezas-Wallscheid, N. et al. (2014). “Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis.” Cell Stem Cell 15, 507–522.
29.Pietras, E. M. et al. (2015). “Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions.” Cell Stem Cell 17, 35–46.
更多信息请关注我们的网站
www.geno-truth.com/singlecell
联系电话：4000-672-118
服务邮箱：service@geno-truth.com
●文献解析|Science—scRNA-seq揭示水螅再生机制
